IGF-1 LR3 liofiliziran,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95 %). Vendar lahko dolgotrajna-uporaba povzroči desenzibilizacijo receptorjev in zahteva občasno dajanje. Visoki odmerki lahko povzročijo hipoglikemijo, zato je treba spremljati raven glukoze v krvi.
Ne ponujamo le praška in kapsul, ampak tudi druge dozirne oblike. Po potrebi se obrnite na našo prodajno ekipo.
Naši izdelki iz
IGF-1 LR3 COA
Kloniranje genov in konstrukcija ekspresijskega vektorja
Genska zasnovaIGF-1 LR3 liofilizirantemelji na zaporedju naravnega IGF-1, vendar z naslednjimi ključnimi spremembami:
N-terminalni podaljšek: Dodajte 13 aminokislin (MFPAMPLSSLFFN) na N-konec IGF-1, da podaljšate njegovo razpolovno dobo in povečate njegovo biološko aktivnost.
Aminokislinska substitucija: Zamenjajte glutaminsko kislino (Glu) na položaju 3 IGF-1 z argininom (Arg), tj. modifikacijo R3, da zmanjšate sposobnost vezave z IGFBP in povečate prosto koncentracijo.
sinteza genov
Pridobite fragment ciljnega gena s kemično sintezo ali pomnoževanjem PCR na podlagi zasnovanega genskega zaporedja IGF-1 LR3. Kemijska sinteza običajno sprejme tehnologijo sinteze v trdni fazi, postopno dodajanje nukleotidov in na koncu sintetizira celotne genske fragmente. Pomnoževanje PCR uporablja znane sekvence IGF-1 za oblikovanje primerjev in pomnoževanje ciljnega gena z reakcijo PCR.
Izbira ustreznega ekspresijskega vektorja je ključni korak pri izražanju beljakovin. Običajno uporabljeni ekspresijski vektorji vključujejo serije pET (kot so pET30a), serije pGEX itd. Ti vektorji imajo učinkovite promotorje, več mest za kloniranje in zaporedja oznak (kot so Hisove oznake), ki olajšajo naknadno čiščenje in detekcijo beljakovin.
Na primer, koraki konstrukcije ekspresijskega vektorja pET30a so naslednji:
Encimsko cepitev: Uporabite restrikcijske endonukleaze, kot sta BamHI in XhoI, da izvedete dvojno encimsko cepitev na vektorju pET32a in genskem fragmentu IGF-1 LR3, pri čemer nastanejo komplementarni lepljivi konci.
Povezava: Encimsko prebavljeni vektor in fragment gena sta povezana z ligazo T4 DNA, da tvorita rekombinantni ekspresijski vektor pET32a-LR3-IGF1.
Preoblikovanje: Transformirajte rekombinantni ekspresijski vektor v kompetentne celice E. coli (kot je DH5) in pridobite pozitivne klone s presejanjem antibiotikov (kot je ampicilin).
Identifikacija: potrdite pravilnost rekombinantnega ekspresijskega vektorja z metodami, kot je PCR kolonije, identifikacija razgradnje z encimi ali sekvenciranje.
Ekspresija beljakovin
Izbor izraznih sevov
Izbira ustreznega ekspresijskega seva je ključna za izražanje beljakovin. Pogosto uporabljeni ekspresijski sevi vključujejo Rosetta (DE3), BL21 (DE3) itd. Ti sevi imajo učinkovite polimerazne sisteme T7 RNA in lahko učinkovito izražajo gene, ki jih poganja promotor T7.
Če za primer vzamemo Rosetto (DE3), njene značilnosti vključujejo: vsebuje gen T7 RNA polimeraze, induciran z izražanjem IPTG. Nosilci genov tRNA za redke kodone lahko učinkovito izražajo eksogene gene, ki vsebujejo redke kodone. Primerno za ekspresijo toksičnih ali težko ekspresiranih beljakovin.
Optimizacija izraznih pogojev
Pogoji izražanja beljakovin, kot so koncentracija induktorja, temperatura indukcije, čas indukcije itd., pomembno vplivajo na izkoristek in kakovost beljakovin. Z optimizacijo pogojev ekspresije je mogoče povečati raven ekspresije IGF-1 LR3.
Koncentracija induktorja: IPTG je pogosto uporabljen induktor, s koncentracijo običajno med 0,1-1 mM. Določite optimalno koncentracijo IPTG z gradientnimi poskusi, da dosežete najvišjo raven izražanja beljakovin.
Temperatura indukcije: Temperatura indukcije je običajno izbrana med 16-37 stopinj. Nižje temperature (kot je 16-20 stopinj) lahko pomagajo zmanjšati razgradnjo beljakovin in tvorbo inkluzijskih telesc ter povečajo donos topnih beljakovin.
Čas indukcije: Čas indukcije je običajno med 2 in 24 urami, optimalni čas indukcije pa se določi z analizo ravni izražanja beljakovin s časovnim vzorčenjem.
Odkrivanje izražanja beljakovin
IzrazIGF-1 LR3 liofiliziranje bil odkrit z metodama SDS-PAGE in Western blot.
SDS-PAGE: Zberite bakterijske vzorce pred in po indukciji, izvedite ultrazvočno fragmentacijo ali kemično lizo, centrifugirajte, da ločite supernatant in oborino, ter ločeno izvedite SDS{1}}PAGE analizo. S primerjavo sprememb beljakovinskih trakov v supernatantu in oborini pred in po indukciji je bila potrjena ekspresija IGF-1 LR3.
Western blot: uporabite specifična protitelesa (kot so protitelesa proti His tag ali protitelesa proti IGF-1) za izvedbo imunoblot analize na proteinih, ločenih s SDS-PAGE, da dodatno potrdite izražanje in molekulsko maso IGF-1 LR3.
Čiščenje beljakovin
Bakterijska liza
Zberite inducirane bakterijske celice in jih lizirajte, da sprostite znotrajcelične beljakovine. Običajne metode krekiranja vključujejo ultrazvočno drobljenje, visoko{1}}tlačno homogenizacijo, kemično krekiranje itd. Če vzamemo ultrazvočno drobljenje kot primer, so koraki naslednji:
Zbiranje bakterij: Centrifugirajte bakterijsko raztopino inducirane ekspresije, da zberete bakterijske celice, in jih resuspendirajte v pufru za lizo (kot je pufer PBS ali Tris HCl).
Ultrazvočna fragmentacija: bakterijsko suspenzijo postavimo v ledeno kopel in zdrobimo z ultrazvočnim motilcem, običajno z uporabo kratkoročne-metode večkratne fragmentacije (kot je vsakokrat 10 sekund, 10-sekundni interval, 10-krat ponovljeno), da preprečimo denaturacijo beljakovin zaradi pregrevanja.
Centrifugalno ločevanje: Centrifugirajte zdrobljeno bakterijsko suspenzijo, da ločite supernatant in oborino. Supernatant vsebuje topne beljakovine, medtem ko oborina lahko vsebuje inkluzijska telesca ali ostanke celic.
Afinitetna kromatografija
Ker rekombinantni IGF-1 LR3 običajno nosi oznako His, ga je mogoče očistiti z afinitetno kromatografijo z nikljevim ionom (Ni NTA).
Priprava kolone: naložite polnilo Ni NTA v kromatografsko kolono in jo uravnotežite z ekvilibracijskim pufrom (kot je PBS, ki vsebuje 20 mM imidazola).
Nalaganje vzorca: Supernatant bakterijskega lizata naložite na kromatografsko kolono, da se IGF-1 LR3 s Hisovo oznako veže na nikljeve ione.
Izpiranje: Kromatografsko kolono sperite s pralnim pufrom (kot je PBS, ki vsebuje 50 mM imidazola), da odstranite nevezane ali šibko vezane nečistoče.
Elucija: Uporabite elucijski pufer (kot je PBS, ki vsebuje 250 mM imidazola), da eluirate IGF-1 LR3, vezan na kromatografsko kolono, in zberite eluent.
Razsoljevanje in koncentracija
Raztopina IGF-1 LR3 po eluciji vsebuje visoko koncentracijo imidazola, ki ga je treba odstraniti s koraki razsoljevanja in koncentracije, da se poveča koncentracija beljakovin.
Razsoljevanje: uporabite kolono za razsoljevanje ali dializno vrečko, da odstranite imidazol iz eluenta in ga nadomestite z ustrezno pufersko raztopino (kot je PBS).
Koncentracija: Koncentrirajte razsoljeno beljakovinsko raztopino z uporabo ultrafiltracijskih cevi ali centrifugalnih koncentratorjev, da povečate koncentracijo beljakovin na želeno raven.
Testiranje čistosti in aktivnosti
Čistost in aktivnost očiščenega IGF-1 LR3 smo odkrili z metodami SDS-PAGE, HPLC ali ELISA.
STRAN-SDS: Analizirajte čistost prečiščenega proteina in potrdite, da ni očitnih pasov nečistoč.
HPLC: Za nadaljnjo analizo čistosti in porazdelitve molekulske mase beljakovin uporabite HPLC z reverzno fazo ali HPLC z izključitvijo velikosti.
ELISA: Encimski imunosorbentni test (ELISA) se uporablja za odkrivanje biološke aktivnosti IGF-1 LR3, njegova stopnja aktivnosti pa se odraža v stopnji vezave na specifična protitelesa.
Postopek sušenja z zamrzovanjem
Načelo sušenja z zamrzovanjem
Liofilizacija je tehnika sušenja, ki odstrani vlago z nizko{0}}temperaturnim zamrzovanjem in vakuumsko sublimacijo. Postopek liofilizacije vključuje tri stopnje: predhodno zamrzovanje, sublimacijsko sušenje in desorpcijsko sušenje, ki lahko maksimirajo aktivnost in stabilnost proteina.
Koraki sušenja z zamrzovanjem
Razdelite prečiščeno raztopino IGF-1 LR3 v steklenice za sušenje z zamrzovanjem ali stekleničke za penicilin in jih postavite v sušilnik za zamrzovanje, da predhodno zamrznete pod -40 stopinj, da popolnoma zamrznete raztopino.
Postopoma zvišajte temperaturo na približno -20 stopinj v pogojih vakuuma, kar omogoči, da led sublimira neposredno v vodno paro in odstrani večino vlage. Na tej stopnji je treba nadzorovati hitrost segrevanja in stopnjo vakuuma, da preprečimo denaturacijo ali kolaps beljakovin.
Nadalje povišajte temperaturo na 20-30 stopinj, da odstranite preostalo vlago in zmanjšate vsebnost vlage v liofiliziranem izdelku pod 1 %. Na tej stopnji je treba vzdrževati visoko stopnjo vakuuma, da se zagotovi popolna odstranitev vlage.
Ko je sušenje končano, hitro zaprite zamrzovalno-plastenko za sušenje ali steklenico s penicilinom, da preprečite ponovni vstop vlage.
Zaščita pred zamrzovanjem
Za zaščito aktivnosti in stabilnosti IGF-1 LR3 med-sušenjem z zamrzovanjem je običajno treba dodati zaščitna sredstva za-sušenje z zamrzovanjem. Običajna zaščitna sredstva za sušenje z zamrzovanjem vključujejo:
- Ogljikovi hidrati: kot so alginat, saharoza, glukoza itd., lahko tvorijo steklaste strukture in stabilizirajo konformacijo beljakovin.
- Polimeri, kot sta polietilenglikol (PEG) in polivinilpirolidon (PVP), lahko povečajo viskoznost raztopin in zmanjšajo agregacijo beljakovin.
- Aminokisline, kot sta glicin in alanin, lahko delujejo kot donorji ali akceptorji vodikove vezi in stabilizirajo strukturo beljakovin.
- Površinsko aktivne snovi, kot so Tween 20, Tween 80 itd., lahko zmanjšajo adsorpcijo proteinov na stene posode in izboljšajo stopnjo predelave.
Če za primer vzamemo trehalozo, je njena dodana količina običajno 1-10-kratna masa beljakovine, ki lahko med sušenjem z zamrzovanjem tvori zaščitno plast, da prepreči denaturacijo beljakovin.
Optimizacija postopka liofilizacije
Optimizacija postopka-sušenja z zamrzovanjem je ključnega pomena za izboljšanje kakovostiIGF-1 LR3 liofiliziran. S prilagajanjem parametrov, kot so temperatura pred zmrzovanjem, temperatura sublimacijskega sušenja, analitična temperatura sušenja in stopnja vakuuma, je mogoče doseči najboljši učinek zamrzni-sušenja.
Temperatura pred zmrzovanjem
Temperatura pred zmrzovanjem mora biti nižja od evtektične točke proteina, da se zagotovi popolno zamrzovanje raztopine. Običajno so izbrane temperature pod -40 stopinj.
Sublimacijska temperatura sušenja
Temperatura sublimacijskega sušenja mora biti nižja od temperature kolapsa proteina, da se prepreči denaturacija proteina ali kolaps posode. Običajno je izbrana okoli -20 stopinj.
Analiza temperature sušenja
Temperatura sušenja pri analizi mora biti višja od temperature sušenja sublimacije, da se odstrani preostala vlaga. Običajno je izbrana 20-30 stopinj.
Stopnja vakuuma
Stopnjo vakuuma je treba vzdrževati na nizki ravni (npr<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
Priljubljena oznake: igf-1 lr3 liofiliziran, Kitajska igf-1 lr3 liofiliziran proizvajalci, dobavitelji
